第1章绪论11.1基因工程的基本概念11.2基因工程的理论和技术11.2.1基因工程所依赖的核心理论11.2.2基因工程所依赖的核心技术21.3基因工程的建立与发展21.3.1基因工程的建立21.3.2基因工程的发展31.4基因工程的产业化及应用61.4.1产业化61.4.2基因工程的应用71.5转基因生物的安全性与伦理91.5.1转基因生物的安全性91.5.2转基因生物的伦理111.6应用事例121.6.1问题的提出121.6.2生化产品生产中存在的问题121.6.3基因工程的用途131.6.4实例13第2章基因142.1“遗传因子”——生物性状遗传的符号142.2基因——位于染色体上的遗传功能单位142.2.1等位基因142.2.2复等位基因152.3顺反子——一个基因一条多肽172.4操纵子——遗传信息传递和表达的统一体182.5超基因202.6假基因212.7断裂基因222.7.1RNA剪接222.7.2内含子的类型242.8重叠基因272.9可动基因292.9.1Ac-Ds系统292.9.2插入序列292.9.3转座子312.9.4P因子342.9.5反转录转座子352.10癌基因和抑癌基因362.11染色体外基因372.11.1质粒372.11.2线粒体基因372.11.3叶绿体基因392.11.4非孟德尔遗传39第3章工具酶413.1限制性核酸内切酶413.1.1宿主的限制和修饰现象413.1.2限制性核酸内切酶的类型423.1.3限制性核酸内切酶的命名463.1.4影响限制性核酸内切酶活性的因素463.1.5限制性核酸内切酶对DNA的消化作用483.1.6限制性核酸内切酶反应的终止493.1.7限制性核酸内切酶酶切反应的操作步骤和注意事项493.2DNA聚合酶503.2.1DNA聚合酶Ⅰ(E.coli)513.2.2大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段523.2.3T4DNA聚合酶523.2.4依赖于RNA的DNA聚合酶533.2.5T7DNA聚合酶533.2.6修饰的T7DNA聚合酶533.3DNA连接酶543.3.1大肠杆菌和T4噬菌体的DNA连接酶543.3.2影响连接反应的因素553.3.3DNA片段在体内和体外的连接——黏性末端的连接553.3.4平齐末端的连接573.3.5连接反应的注意事项593.4DNA及RNA的修饰酶593.4.1末端脱氧核苷酸转移酶593.4.2T4多核苷酸激酶603.4.3碱性磷酸酶613.5核酸外切酶613.5.1核酸外切酶Ⅶ623.5.2核酸外切酶Ⅲ623.5.3λ核酸外切酶和T7基因6核酸外切酶633.6单链核酸内切酶633.6.1S1核酸酶633.6.2Bal31核酸酶643.7细胞裂解酶653.7.1溶菌酶653.7.2蛋白酶K653.7.3纤维素酶653.7.4其他裂解酶663.8其他663.8.1琼脂糖酶663.8.2核酸酶抑制剂66第4章载体674.1质粒载体674.1.1质粒的一般生物学特性674.1.2质粒载体的选择714.1.3常用的大肠杆菌质粒载体724.2噬菌体载体794.2.1单链噬菌体载体804.2.2双链噬菌体载体834.3柯斯质粒载体894.3.1柯斯质粒载体的组成894.3.2柯斯质粒载体的特点894.3.3柯斯质粒载体的应用904.4噬菌粒载体914.4.1噬菌粒载体的概念914.4.2pUC118和pUC119噬菌粒载体924.4.3pBluescript噬菌粒载体924.5人工染色体载体934.5.1酵母人工染色体载体934.5.2细菌人工染色体载体954.5.3P1人工染色体载体96第5章重组DNA分子的转化与重组子筛选985.1DNA分子的转化与扩增985.1.1DNA重组转化的基本概念985.1.2受体细胞的选择995.1.3转化方法1015.1.4转化率及其影响因素1045.1.5转化细胞的扩增1055.1.6进行转化时的注意事项1055.2重组体克隆的筛选与鉴定1055.2.1遗传检测法1065.2.2物理检测法1105.2.3核酸杂交法1125.2.4PCR检测法1155.2.5克隆基因定位法1155.2.6测序检测法1175.2.7外源基因表达产物检测法117第6章大肠杆菌基因工程1206.1外源基因在大肠杆菌高效表达的原理1206.1.1启动子1206.1.2终止子1256.1.3核糖体结合位点1266.1.4密码子1276.1.5质粒拷贝数1286.2大肠杆菌工程菌的构建策略1306.2.1包涵体型异源蛋白的表达1306.2.2分泌型异源蛋白的表达1336.2.3融合型异源蛋白的表达1356.2.4寡聚型异源蛋白的表达1386.2.5整合型异源蛋白的表达1426.2.6蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建1436.3重组异源蛋白的体外复性活化1456.3.1蛋白质变性的动力学原理1456.3.2折叠中间状态分子的集聚作用1466.3.3包涵体的溶解与变性1476.3.4异源蛋白的复性与重折叠1496.4基因工程菌的遗传不稳定性及其对策1546.4.1基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制1556.4.2改善基因工程菌不稳定性的策略1566.5大肠杆菌基因工程的案例158第7章酵母菌基因工程1637.1酵母菌的宿主系统1637.1.1提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌1637.1.2抑制超糖基化作用的突变宿主菌1647.1.3减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌1647.1.4内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌1657.2酵母菌的载体系统1667.2.1酿酒酵母的2μ环状质粒1667.2.2乳酸克鲁维酵母的线型质粒1677.2.3果蝇克鲁维酵母的环状质粒1687.2.4含ARS的YRp和YEp1697.2.5含CEN的YCp1697.2.6穿梭载体1707.3酵母菌的转化系统1717.3.1酵母菌的转化程序1727.3.2转化质粒在酵母细胞中的命运1727.3.3用于转化子筛选的标记基因1737.4酵母菌的表达系统1757.4.1酵母菌启动子的基本特征与选择1757.4.2酵母菌启动子的可调控表达系统1767.4.3外源基因在酵母菌中表达的限制因素1787.4.4酵母菌表达系统的选择1787.5酵母菌基因工程的案例180第8章核酸的分离纯化与目的基因的克隆1848.1核酸的分离纯化1848.1.1核酸分离提取的原则1848.1.2核酸的分离提取1858.1.3质粒DNA的提取1888.1.4RNA的提取1898.1.5核酸的检测1908.2目的基因的克隆1928.2.1鸟枪法1928.2.2cDNA法1958.2.3PCR扩增法1988.2.4化学合成法2088.2.5基因文库的构建210第9章基因组2149.1基因组剖析2149.1.1基因组序列复杂性2149.1.2原核生物基因组2169.1.3真核生物基因组2209.2基因组测序2279.2.1DNA测序方法2279.2.2基因组测序2349.2.3序列组装2369.3基因组序列注释2399.3.1搜寻基因2399.3.2基因注释2469.3.3基因功能检测2489.3.4高通量基因功能研究方法2499.4功能基因组学2519.4.1组学简介2519.4.2转录物组2519.4.3蛋白质组2529.4.4基因本体2539.5基因组表观遗传2569.5.1什么是表观遗传2569.5.2位置效应2589.5.3DNA甲基化2599.5.4染色体重建2599.6基因组编辑2609.6.1遗传重组2609.6.2基因敲除2659.6.3新一代的基因组定点编辑技术269第10章蛋白质工程28210.1蛋白质工程的基本概念28210.1.1蛋白质工程的基本特征28210.1.2蛋白质工程的研究内容和应用28310.1.3蛋白质工程实施的必要条件28310.2基因的体外定向突变28410.2.1局部随机掺入法28410.2.2碱基定点转换法28510.2.3部分片段合成法28610.2.4引物定点引入法28710.2.5PCR扩增突变法28910.3基因的体外定向进化29010.3.1易错PCR29110.3.2DNA改组29110.3.3体外随机引发重组29110.3.4交错延伸29210.3.5过渡模板随机嵌合生长29210.3.6渐增切割杂合酶生成29410.3.7同源序列非依赖性蛋白质重组29510.3.8突变文库的筛选模型29610.4蛋白质工程的设计思想与应用29710.4.1提高蛋白质或酶的稳定性29710.4.2减少重组多肽链的错误折叠29710.4.3改善酶的催化活性29710.4.4消除酶的被抑制特性29710.4.5修饰酶的催化特异性29810.4.6强化配体与其受体的亲和性298第11章途径工程29911.1途径工程的基本概念29911.1.1途径工程的基本定义29911.1.2途径工程的基本过程30011.1.3途径工程的基本原理30211.2途径工程的研究战略30311.2.1在现存途径中提高目标产物的代谢流30311.2.2在现存途径中改变物质流的性质30411.2.3利用已有途径构建新的代谢旁路30511.3初级代谢的途径工程30511.3.1发酵生产乙醇的基本战略30611.3.2酵母菌属乙醇发酵途径的改良30811.3.3高产乙醇的重组大肠杆菌的构建30911.3.4直接利用太阳能合成乙醇的光合细菌途径设计31111.4次级代谢的途径工程31211.4.1提高次级代谢产物的手段31211.4.2红霉素(聚酮类抗生素)的生物合成31311.4.3提高红霉素A产量的策略315附录318参考文献336